貨號：CB0234

存儲條件：-20oC保存，一年有效。Protein A/G Agarose Beads 4oC保存（不可-20℃凍存）。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡介

本免疫沉淀試劑盒適合用于無標(biāo)簽蛋白、內(nèi)源性蛋白等的下拉富集實(shí)驗(yàn)。試劑盒包含實(shí)驗(yàn)所需各種緩沖液，Protein A/G agarose beads 配合客戶自配的特異性抗體便捷快速的完成免疫沉淀或者免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)過程。本試劑盒適用于動(dòng)物細(xì)胞樣品的免疫沉淀過程，試劑盒中的緩沖液配方經(jīng)過優(yōu)化可以充分裂解細(xì)胞樣本，有利于蛋白的釋放和后續(xù)IP/Coip實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。試劑盒提供的Normal Rabbit/mouse IgG可作為陰性對照排除beads的非特異性結(jié)合，如IP一抗為其他來源則需選擇與之來源相同的IgG作為對照。

使用說明：

1. 蛋白提取

1.1 懸浮細(xì)胞樣本

250-1000×g室溫離心5min收集細(xì)胞。如必要可使用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)胞盡量分散開。可參考每5-10x105細(xì)胞加入100-200μl的比例加入的動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液（用之前按照1:100比例添加Protease Inhibitor Cocktail (100X)）。輕彈管底或適當(dāng)吹打，以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，建議分裝成5-10x105細(xì)胞/管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。充分裂解后，10,000-14,000×g在4oC 離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。

注：裂解后會(huì)出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會(huì)產(chǎn)生沉淀物。

1.2 貼壁細(xì)胞樣本

吸除培養(yǎng)液。如有必要，用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。按照每5-10x105細(xì)胞(相當(dāng)于6孔板的一個(gè)孔)加入100-200μl的動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液（用之前按照1:100比例添加Protease Inhibitor Cocktail (100X)），適當(dāng)吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸動(dòng)物細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。植物細(xì)胞宜在冰上裂解2-10min。充分裂解后，10,000-14,000×g在4oC 離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后會(huì)出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會(huì)產(chǎn)生沉淀物。

1.3 檢測蛋白提物中的蛋白濃度。并留存少量樣本用于Input對照。

2免疫沉淀/共沉淀實(shí)驗(yàn)

2.1 瓊脂糖珠清洗

瓊脂糖珠存儲在保護(hù)液中，使用前需要充分清洗。重懸混勻protein A/G瓊脂糖珠后取適量混懸液（如總體積100ul，beads含量為25ul，吸取beads時(shí)建議用剪刀減去槍尖部分），添加漂洗緩沖液或植物裂解緩沖液至500ul，輕輕混懸吹打protein A/G瓊脂糖珠，6000g 4℃離心30s，小心去除上清，不要吸到凝膠。重復(fù)以上步驟2-3次。

2.2 protein A/G 瓊脂糖與抗體結(jié)合

（1）抗體稀釋：按照抗體說明書的建議稀釋抗體至工作濃度，或者配成終濃度為5-50ug/ml的抗體工作液，置于冰上備用。

（2）陰性對照設(shè)置：稀釋試劑盒中帶的與抗體來源相同的IgG，如一抗來源為Rabbit，則選Normal Rabbit IgG，稀釋為與上一步抗體同樣的濃度作為正常IgG工作液，用于陰性對照或者降低背景；

（3）抗體吸附：將2.1 步驟清洗完的protein A/G瓊脂糖珠6000g 4℃離心30s，并吸除上清，加入100ul抗體工作液或IgG 工作液（目的抗體和IgG吸附可各做一組），重懸后室溫在翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育15min-1h。

（4）洗滌：孵育完抗體后添加500ul 漂洗緩沖液，移液器輕輕吹打懸浮 protein A/G 瓊脂糖珠，冰浴并置于搖床上5min，然后6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。重復(fù)此步驟3次。

（5）（可選）將洗滌后的protein A/G瓊脂糖珠與樣品在4℃孵育1小時(shí)后離心分離，以去除與IgG有非特異性結(jié)合的蛋白。

（6）取20ul吸附好抗體（目的抗體與IgG組各做一組）的protein A/G 瓊脂糖珠添加到100ul蛋白樣品中，置于搖床或者翻轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2-4h或者4℃過夜孵育。孵育結(jié)束后，6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。可保留部分上清用于檢測實(shí)驗(yàn)效果。

（7）洗滌：向（6）中去除上清的管子中添加500ul的漂洗緩沖液，吹打清洗瓊脂糖珠，并重復(fù)清洗3-5次。此步驟同時(shí)可向漂洗緩沖液中按照1:100的比例添加C0101 蛋白酶抑制劑，以減少蛋白的降解。

2.3 洗脫

酸洗脫：向清洗干凈的protein A/G 瓊脂糖珠（20ul）中添加50ul 洗脫緩沖液，吹打混勻后在搖床或者翻轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5min，孵育時(shí)間不建議太長，最長不超過15min。

孵育結(jié)束后6000g 4℃ 離心30s，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中并添加5ul 中和緩沖液。為提高洗脫效率，洗脫步驟可重復(fù)1-2次。洗脫后的蛋白可在-20或-80長期保存，或者借用于后續(xù)檢測分析。

變性洗脫：后續(xù)不用于其他檢測分析的話，可使用變性洗脫的方式，在洗滌獲得的protein A/G瓊脂糖珠中添加50ul 2*loading buffer ，95℃加熱5-10min。6000g 4℃ 離心30s，取上清可用于SDS-PAGE或WB檢測。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒中提供的洗脫方式為酸洗脫，如不需回收beads也可添加 loading buffer 進(jìn)行煮樣洗脫。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中如涉及到磷酸化修飾或乙酰化蛋白，則需要添加磷酸酶抑制劑或去乙酰化抑制劑。

3. Beads使用前應(yīng)保證充分混勻，混勻方式不建議劇烈渦旋震蕩。

4. 本產(chǎn)品僅限專業(yè)人員科學(xué)研究使用，不可用于臨床診斷或者治療，不可存放于普通住宅內(nèi)。

5. 為了您的安全健康，請穿戴一次性手套操作。